Важно! РНК. Количественная оценка выделения.

 

При выделении нуклеиновых кислот часто требуется определить, сколько получено ДНК или РНК в результате выделения.
Часто из-за маленького количества выделяемого материала визуализировать ДНК или РНК с помощью методов электрофореза не представляется возможным. В таких случаях используют оптические методы: спектрофотометр (типа Нанодроп) или при помощи красителя (типа Qubit).
К сожалению, оценивая количество выделенного материала, совершается ряд ошибок, которые приводят к неправильной интерпретации результатов. Больше всего ошибок совершается при оценке количества РНК выделенной как свободно циркулирующей в плазме. Из плазмы здорового человека, по данным на сегодняшний день, выделяется от 0 до 150 нг тотальной нуклеиновой кислоты из 1 мл плазмы. Чаще всего, выделяется от 2 до 15 нг из 1 мл. У людей с онкологическими заболеваниями количество выделяемых нуклеиновых кислот увеличивается до 1000 нг и более. Но при исследовании плазмы здоровых людей очень легко ошибиться в оценках.

Наиболее часто встречаемые ошибки:

1. выбор контроля
для контроля выделения РНК нужно использовать "защищенную" РНК, типа бактериофага MS2. Внесение в плазму перед выделением контроля в виде одноцепочечного олигонуклеотида приводит к быстрой деградации такого контроля ферментами, присутствующими в плазме.

2. спектрофотометрическая оценка количества и чистоты по оптической плотности
попытка оценить количество и качество выделенной РНК на спектрофотометре имеет несколько потенциальных ошибок:
- многие приборы дают сильные искажения при измерении низких концентраций
- при использовании для выделения роботов, следы компонентов буферов, которые использовались в наборе, всегда дают искажения получаемых значений. Эту ошибку легко выявить, сделав контрольное выделение вручную.

3. спектрофотометрическая оценка количества с использованием красителя
несмотря на то, что этот метод является наиболее точным, использование этого метода может приводить к большим заблуждениям из-за незнания состава и принципа работы конкретного набора для выделения. Проблема заключается в том, что некоторые компании для улучшения результатов выделения использут в своих наборах "балластную" РНК. Но мнению производителей, такая РНК позволяет улучшить общий выход. Не все производители сообщают о такой детали. В результате, исследователь получает при измерении всегда "стабильный" выход, на самом деле не имеющий ни малейшего отношения к реально выделяемому количеству РНК.

Чтобы не попасться на описанныш выше ошибках при измерении количества РНК, мы настоятельно рекомендуем оценивать количество выделенной РНК с использованием ПЦР или других инструментальных методов. Конечно, следует помнить, что при использовании любого метода будут свои специфические ошибки о которых нужно помнить и принимать во внимание.

Для планирования работы с выделяемой РНК и ДНК мы советуем ознакомиться со следующим обзором: "Нормализация и оценка качества выделения НК"