Праймеры
Как правильно выбрать праймер
• Если мРНК имеет поли(A) 3' хвост, то можно использовать праймер oligo-dT для одновременного праймирования всех мРНК.
• Если вы хотите получить кДНК только из подмножества всей мРНК, то можно использовать специфичный для последовательности праймер, который будет связываться только с одной последовательностью мРНК.
• Если вы хотите получить части кДНК, которые были бы разбросаны по всей мРНК, то вы можете использовать случайный коктейль праймеров, который производил бы кДНК из всех мРНК, но эти кДНК не были бы полной длиной.
Основными преимуществами случайного праймирования являются получение более коротких фрагментов кДНК и повышение вероятности того, что 5'-концы мРНК будут преобразованы в кДНК.
Поскольку обратная транскриптаза обычно не достигает 5'-конца длинной мРНК, случайные праймеры могут иметь в этом случае преимущество.
Специфические праймеры
Специфические праймеры, гомологичные конкретной последовательности, обладают наибольшей специфичностью и являются наиболее подходящими из вариантов праймеров для обратной транскрипции. Однако они не обеспечивают гибкости олиго (dT) и случайных праймеров, а это означает, что необходимо проводить отдельную реакцию синтеза кДНК для каждого исследуемого гена. Это делает специфические праймеры менее оптимальными для обработки ограниченных образцов тканей или клеток.
В одностадийных реакциях ОТ-ПЦР всегда используется ген-специфический праймер для синтеза первой цепи кДНК, в то время как двухэтапная ОТ-ПЦР позволяет использовать различные варианты праймеров.
Праймеры Oligo (dT)
Праймеры Oligo (dT) являются предпочтительным выбором для двухэтапных реакций синтеза кДНК из-за их специфичности в отношении мРНК и потому, что они позволяют изучать множество различных мишеней из одного пула кДНК. Однако, поскольку они всегда инициируют обратную транскрипцию на 3´ конце транскрипта, сложная вторичная структура может привести к неполному синтезу кДНК.
Обычно используют несколько типов праймеров олиго (dT).
Олиго (dT)20 представляет собой гомогенную смесь 20-мерных тимидинов, а олиго (dT)12–18 представляет собой смесь 12-мерных и 18-мерных тимидинов. Также, заякоренные олиго (dT) праймеры предназначены для предотвращения проскальзывания поли(А), обеспечивая их отжиг на стыке 3´UTR / полиА. Пример заякоренного олиго (dT)20 представляет собой смесь праймеров, состоящую из цепочки из 20 остатков дезокситимидиловой кислоты (dT), за которыми следует dV (либо dG, dA, либо dC), а затем dN (dA, dT, dG или dC). Благодаря вариабельной концевой последовательности, праймер прикрепляется к 5'-концу поли (А) хвоста мРНК и предотвращает праймирование внутри поли (А) хвоста.
Выбор лучшего олиго (dT) праймера может частично зависеть от температуры обратной транскрипции. Более термостабильные обратные транскиптазы могут работать лучше с более длинными праймерами, которые остаются более плотно отожженными при повышенных температурах по сравнению с их более короткими аналогами.
Праймеры олиго (dT) не рекомендуются в качестве единственного праймера для синтеза кДНК, если для нормализации в эксперименте ПЦР в реальном времени используется 18S рРНК, поскольку праймер олиго (dТ) не отжигается.
Случайные праймеры
Случайные праймеры отлично подходят для синтеза больших пулов кДНК. Они также идеально подходят для неполиаденилированной РНК, такой как бактериальная РНК, потому что они отжигаются по всей молекуле-мишени.
Использование комбинации случайных и олиго (dT) праймеров может иногда повысить качество данных за счет объединения преимуществ обоих, если они используются в одной и той же реакции синтеза кДНК первой цепи.
Следует помнить, что случайные праймеры используются только в двухэтапных реакциях ОТ-ПЦР.