Выделение ДНК/РНК из парафинизированных образцов, фиксированных в формалине (FFPE), на магнитных частицах SileksMagNA

Особенность выделения из парафинизированных образцов фиксированных в формалине и последующей работы с выделенным материалом заключается в том, что в процессе фиксации и парафинизации нуклеиновая кислота (ДНК и РНК) в образцах подвергается сильной фрагментации и химической модификации формальдегидом. В результате нуклеиновая кислота (НК) выделяемая из парафинизированных образцов чаще всего представляет собой сильно фрагментированную НК, принципиальным образом отличающуюся от НК, выделяемой из свежих или замороженных образцов. Влияние обработки формальдегидом сказывается не только на сложности выделения НК, но и на последующих процедурах с участием различных ферментов. Формальдегидные модификации и следы самого формальдегида оказывают сильное ингибирующее действие на многие регулярно используемые ферменты включая термостабильные полимеразы, применяемые в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Определить в геле качество РНК, выделенной из парафинизированных образцов, по наличию полос 18S и 28S рибосомальной РНК часто бывает невозможным. Полосы 18S и 28S рРНК в лучшем случае слабые или сильно размазанные, а в худшем случае могут полностью отсутствовать.
В зависимости от качества образцов размер НК может сильно варьировать. Средний размер РНК, выделяемой из парафинизированных образцов, составляет около 100 нуклеотидов. Размер фрагментов ДНК может быть в несколько раз больше, иногда до 500 нуклеотидов

Качество образцов и целостность НК определяется разными факторами:
- тип ткани,
- время хранения образца,
- условия фиксации и условия заливки (рН используемого буфера, температура, качество реагентов),
- условия хранения образца.

Процедура выделения НК, предлагаемая в данном наборе, в значительной степени уменьшает количество перекрестных сшивок, образуемых в процессе фиксации формальдегидом.
Однако следует понимать, что деградированная в процессе фиксации НК не может быть использована для таких же точно типов исследований, как нуклеиновая кислота стандартного качества.
Чтобы использовать полученную из парафинизированных образцов НК может потребоваться подбор и оптимизация условий ПЦР и обратной транскрипции (ОТ).

ОЧЕНЬ ВАЖНО !!!
Мы рекомендуем модифицировать систему для амплификации с таким расчетом, чтобы результирующий продукт (ампликон) имел длину не больше 100 пар оснований. Для проведения ОТ мы рекомендуем использовать ген-специфические праймеры или рендомизированные праймеры, а от использования олиго(дТ) праймера следует отказаться.