Выделение нуклеиновых кислот. Выбор метода. Часть 2
Алексей Жигулин, ООО «Силекс», info@sileks.com
21 марта 2021 года
Критерии для выбора метода выделения нуклеиновых кислот
Идеальный метод выделения должен соответствовать следующим критериям:
- должен соответствовать поставленной задаче
- быть понятным и простым в использовании, а в зависимости от страны, в которой он используется, может быть важно свести к минимуму специализированное оборудование или биохимические знания
- быть воспроизводимым
- быть исчерпывающим (обеспечивать максимально полное выделение)
- выбранный метод выделения ДНК и/или РНК должен обеспечивать получение образцов, готовых к использованию в последующих молекулярных и технических приложениях
- возможность автоматизации процедуры выделения
При выборе метода некоторые критерии могут иметь приоритет, иногда приоритетными могут быть несколько критериев сразу, но чаще всего истинный приоритет всегда один, а остальные критерии выступают в качестве дополнения.
Рассмотрим каждый критерий по отдельности.
1. Соответствовать поставленной задаче
Метод выделения всегда определяется задачей.
Что нужно выделять: ДНК, тотальную РНК, мРНК, микро РНК, тотальную нуклеиновую кислоту.
Из чего нужно выделять: кровь, плазма или сыворотка, соскобы, ткань, клетки, кости, слюна, моча, парафинированные блоки, волосы, растения, пищевые продукты, объекты органического или неорганического происхождения для криминалистического анализа.
Для чего нужно выделять: для молекулярно-биологических процедур (клонирование, рестрикция, секвенирование, гибридизация, блоты и т.п.), для медицинских исследований (полимеразная цепная реакция, секвенирование и т.п.), для физических методов анализа (кристаллография, электронная микроскопия и т.п.).
Количество исходного материала: неограниченное, ограниченное, критически малое.
Возможность повторить выделение: без ограничения, возможность нескольких повторений, единственная возможность.
Возможно, какая-то задача не вошла в приведенный перечень, но смысл, думаю, понятен.
Определившись с задачей, как правило, всегда становится понятно, какой метод лучше применить.
Например, для рутинного выделения хромосомальной ДНК из бактерий или геномной ДНК из крови для молекулярно-биологической лабораторной задачи совершенно нет необходимости использовать коммерческие наборы. И наоборот, для выделения из единственного крохотного образца костной ткани для криминалистического или медицинского анализа лучше воспользоваться коммерческим набором.
2. Быть понятным и простым в использовании, быть адаптированным к месту применения
Бывают случаи, когда профессиональные возможности персонала лаборатории или ее техническое оснащение не позволяют использовать определенные методы. Так, в некоторых лабораториях есть проблемы с одноразовым пластиком или пластиком нужного качества, отсутствуют скоростные центрифуги, персонал не имеет соответствующую квалификацию и возможность выполнять работу определенного уровня сложности.
3. Воспроизводимость
При всей серьезности этого понятия, воспроизводимость метода выделения имеет решающее значение исключительно в медицинских, криминалистических и аналитических исследованиях. В научных исследованиях воспроизводимостью часто пренебрегают в угоду простоте, в зависимости от задачи.
4. Максимально полное выделение
Максимально полное выделение для максимальной чувствительности имеет решающее значение исключительно в медицинских, криминалистических и аналитических исследованиях. В научных исследованиях максимально полное выделение в большинстве случаев не имеет решающего значения. Часто, большее значение имеет корректное соотношение определенных нуклеиновых кислот в образце, например соотношение геномной ДНК к определенным мРНК, позволяющее вести оценку уровня экспрессии и нормализацию. Большинство современных методов и наборов на их основе позволяют выделять максимальное количество нуклеиновой кислоты из исходного образца. Проблемой остается качество получаемого материала, которое сказывается на чувствительности в последующих этапах анализа.
5. Метод выделения должен обеспечивать качество в последующих приложениях
В одних приложениях качество выделения имеет большое значение, в других – меньше. Для анализа ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут использоваться любые методы выделения. Современный ПЦР хорошо работает с ДНК имеющую разного рода примеси. Часто в реакционную смесь можно вносить необработанный образец (кровь, кусочек ткани, клетки и т.п.) и результат будет хорошим.
Для дальнейшего анализа выделенной РНК часто требуется наработка кДНК в реакции синтеза первой цепи (обратной транскрипции). На эту реакцию в значительно большей степени влияют примеси, остающиеся при выделении РНК. Как правило, методы выделения РНК более сложны и дают значительно больше расхождений по качеству.
6. Возможность автоматизации
Ни один метод выделения нуклеиновых кислот при использовании его со средствами автоматизации полного цикла не дает тех же результатов, как при ручном режиме выделения. Причин для такого расхождения в качестве выделения может быть много и все они зависят от прибора конкретного производителя и конкретного набора или метода, который стараются автоматизировать. Решением проблемы мог бы быть прибор, созданный под конкретные наборы (здесь возникает новая проблема – привязка прибора к конкретному производителю наборов) или разработка совершенно новой технологии, использующей другие принципы в методе выделения и анализа.
Заключение
Здесь специально не приводилось сравнений «классических» методов выделения с наборами разных фирм и производителей. Наше мнение – у каждого метода, набора, протокола – есть своя задача и свой потребитель.
При выборе метода и конкретного набора нужно руководствоваться целесообразностью. Часто для отдельных задач вполне достаточно «классических» методов выделения. За последнее время многое из этих «классических» методов существенно улучшены. Эти методы легко отыскать в интернете, ограничив поиск последними годами.
Наборы хороши в тех случаях, когда требуется строгая стандартизация и воспроизводимость. При выборе набора всегда следует помнить, что идеального набора нет. Набор должен выполнять конкретную поставленную задачу, но не надо рассчитывать, что один набор решит все задачи.
Универсальных методов, как и наборов, не существует. Выделение ДНК отличается от выделения РНК, даже когда кажется, что принцип метода похож или одинаков. В результате – разный конечный выход и качество.
Когда появляется новый метод, набор, способ, протокол, возникает ощущение, что это всегда лучше. Увы, это не так. Часто, новый вариант старого метода — это маркетинговый ход, чтобы привлечь внимание к новому продукту. Каждый метод, реализованный в виде набора, имеет четкие критерии для оценки: чистота выделяемой ДНК и РНК, получаемое количество и далее по списку. Не видитесь на рекламу, выбирайте по задачам.